ПГД - диагностика эмбриона методом NGS

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) предназначена для выявления у готовых к подсадке эмбрионов различных отклонений в наследственном материале. Их относят к основным причинам патологии эмбриогенеза, нарушения имплантации и замершей беременности. ПГД – высокотехнологичное, востребованное и активно развивающееся направление репродуктивной медицины. В настоящее время используется несколько методик, отличающихся чувствительностью и степенью информативности. И самый точный из существующих вариантов ПГД – это диагностика эмбриона методом NGS.

Что такое NGS

NGS (Next generation sequencing) дословно переводится как «секвенирование нового (следующего) поколения». Его называют также высокопроизводительным секвенированием. Этот термин чаще всего и используется для описания всей диагностической методики. NGS – перспективная и активно развивающаяся технология. В настоящее время ее используют в различных отраслях медицины, в том числе в репродуктологии в качестве преимплантационной генетической диагностики эмбрионов. Секвенирование – это определение последовательности нуклеотидов (базовых структурных единиц наследственного материала) в молекулах РНК и ДНК. Фактически в результате такого исследования составляют формальное описание их первичной структуры. А сравнение полученного результата с нормативными данными позволяет выявлять участки различных отклонений (дефектов) и тем самым выявлять мутации. Точность и полнота секвенирования зависят от используемой технологии. ПГД методом NGS признан самым информативным способом отбора эмбрионов без летальных мутаций. Его принципиальные прогрессивные отличия от более ранних видов секвенирования:

• Одновременное автоматизированное «прочтение» нескольких геномных участков (секвентов). Это существенно повышает производительность рабочего цикла.
• С помощью NGS анализируется структура сразу всех хромосом, что делает ПГД действительно высокоинформативной процедурой.
• Процесс секвенации при NGS идет не параллельно, а каждый сегмент генетического кода анализируется многократно. Такой подход позволил существенно повысить точность ПГД. Считается, что вероятность ошибки или «пропуска» мутации при использовании этой технологии очень мала – ниже 0,001%.

Диагностика эмбриона методом NGS внедрена в клиническую практику не так давно. Но она уже признана перспективным и наиболее результативным способом предимплантационного скрининга. Первый ребенок, зачатый путем подсадки отобранного с помощью NGS эмбриона, родился в мае 2013 года. В настоящее время ПГД с использованием секвенирования нового поколения активно используется специалистами ведущих мировых репродуктивных центров. Доступна она и пациентам ICLINIC.

Когда целесообразно проведение ПГД?

К относительным показаниям для этого исследования относят:

• Наличие у женщины в анамнезе привычного невынашивания с развитием самопроизвольных абортов или замершей беременности на разных сроках гестации.
• Выраженный мужской фактор бесплодия, сопряженный с нарушениями сперматогенеза.
• Повторные неудачные попытки ЭКО при подсадке эмбрионов хорошего и даже отличного качества. И предпочтение при этом обычно отдается методике a-CGH, так как нарушения имплантации и прекращения эмбриогенеза в основном обусловлены хромосомными аномалиями.
• Вступление в протокол ЭКО женщины старшего репродуктивного возраста (старше 35 лет).

К абсолютным показаниям относят:

1. Носительство хотя бы одним из супругов хромосомной аномалии, наличие в семье лиц различной степени родства с такими заболеваниями.
2. Сцепленные с полом заболевания, передающиеся по наследству.

Как проводят диагностику эмбриона методом NGS

Предимплантационная генетическая диагностика методом NGS включает несколько последовательных процедур, которые проводятся в течение 3 этапа ЭКО.

• Биопсия эмбриона на стадии бластоцисты для получения нескольких клеток. При этом чаще всего источником генетического материала служит трофобласт (трофоэктодерма), ведь взятие его небольшой части сопряжено с низким риском последующих нарушений эмбриогенеза.
• Выделение нуклеиновых молекул – как заключенной в хромосомах ядерной ДНК, так и митохондриальной РНК.
• Создание библиотеки – основы для дальнейшего генетического анализа. Это множество фрагментов (секвентов) всех выделенных нуклеиновых молекул сходной длины. К ним лигируют (подшивают) адаптеры для дальнейшей идентификации и фиксации концов, затем каждый фрагмент замыкается в кольцо и дробится.
• Множественная и циклическая амплификация (копирование) всех элементов библиотеки с получением ампликонов. Этот процесс происходит с помощью ПЦР и позволяет получать обширный материал для дальнейшего чтения. Ампликоны выступают в роли образцов.
• Множественное, повторное и непараллельное прочтение фрагментов. Каждый из них анализируется несколько сотен раз. На основе полученной информации о последовательности нуклеотидов и подсчета хромосом создается модель первичной ДНК/РНК, которая визуализируется на экране в виде графиков с пиками или провалами на местах выявленных аномалий.

Результаты NGS помогают выбраковывать бластоцисты с летальными и клинически значимыми мутациями. Оставшиеся после предимплантационной генетической диагностики эмбрионы допускаются к дальнейшей подсадке (переносу в полость матки).

Каковы преимущества ПГД методом NGS?

• Высокая информативность и проведение сочетанного анализа. ПГД с использованием NGS позволяет выявлять одномоментно структурные и количественные хромосомные аномалии, сбалансированный (отличающийся от нормального) набор хромосом, однородительскую дисомию, локальные генные мутации, моногенные заболевания и ряд других нарушений.
• Высокая чувствительность и точность (99,99%), ведь при диагностике эмбриона методом NGS для каждой хромосомы получают сразу несколько сотен расшифровок. Поэтому эта методика признана референсной (эталонной) в отношении остальных вариантов эмбрионального генетического скрининга.
• Значительное повышение вероятности наступления беременности. В среднем при переносе только одного эмбриона процент успеха ЭКО с использованием предимплантационной генетической диагностики методом NGS составляет 70%. Это существенно выше, чем результативность базового протокола.
• Низкий риск создания критичного дефицита эмбриональной ткани после биопсии. Образец ткани для анализа забирают однократно, на 5 сутки после оплодотворения. К этому моменту эмбрион состоит в среднем из 80–100 клеток, и взятие 5–6 из них не становится критичным для дальнейшего развития зародыша. Поэтому предимплантационная генетическая диагностика методом NGS не повышает риск нарушений эмбриогенеза.
• Максимальная автоматизация.

Еще одно преимущество диагностики эмбриона методом NGS – относительно небольшая стоимость. Это объясняется высокой производительностью технологии. Возможность проведения ПГД с помощью NGS доступна далеко всем центрам вспомогательных репродуктивных технологий. Поэтому пациентам нередко предлагаются альтернативные методики секвенирования с более низкими чувствительностью и точностью. Клиника репродуктивной медицины ICLINIC – одно из первых специализированных учреждений, где для генетического скрининга эмбрионов начали использовать прогрессивную методику NGS. Поэтому специалисты ICLINIC имеют достаточный опыт в проведении такой ПГД в протоколах ЭКО. При этом используется оборудование последних поколений. Еще одно преимущество Клиники – услуга криоконсервации, что бывает целесообразно на этапе ожидания результатов скрининга или для сохранения отобранных эмбрионов для повторных циклов ЭКО.